蒲公英提取物对MKN－45胃癌细胞株P53和Ki67表达的影响
文
詹锋刘晓颖荣卡彬王昌俊杨素清
摘要
目的检测蒲公英提取物对MKN45胃癌细胞的P53、Ki67两种蛋白表达的影响，探求中草药蒲公英抗癌作用的依据。
方法以小鼠血清药物学方法配制蒲公英提取物药液，对MKN45胃癌细胞进行培养传代，取处于对数生长期的同一代细胞加入药液血清，应用免疫组化(S－P法)检测p53、Ki67的表达状况。
结果4组中p53的表达分别为%(5/5)、60%(3/5)、80%(4/5)和60%(3/5)，所有含药组合并后其P53阳性表达率与对照组之间具有显著性差异(p＜0.05)，各含药组的Ki67阳性表达率均高于对照组，分别为87%、96%、97%、92%，但目前尚未发现它们之间具有显著性差异(p＞0.05)。
结论蒲公英可能有降低胃癌细胞p53的阳性表达的作用。
关键词：蒲公英提取物、MKN－45胃癌细胞、P53表达、Ki67表达
正文
蒲公英临床上多用于咽喉炎、支气管炎、乳腺炎和泌尿系感染等感染性疾病的治疗［1］，也用于抑制幽门螺杆菌的治疗［2］。近20年来逐渐出现了蒲公英抗癌作用的实验报道。本实验通过测试不同浓度的蒲公英提取物对实验室培养的胃癌细胞株的P53和Ki67蛋白的表达，目的在于通过实验手段检测单味中药蒲公英的抗癌作用，寻找其抗癌作用的循证医学证据。
材料与方法
1
药物
蒲公英提取物(粉剂)购自康瑞生物工程有限公司。使用时用蒸馏水配成高、中、低三种不同浓度的溶液，4℃冷藏保存，供小鼠灌胃、制备含药血清之用。
2
MKN－45胃癌细胞株
由医院提供。
3
动物
小鼠，购自中山大学医学实验动物中心。
4
试剂
鼠抗人P53、Ki－67单克隆抗体及SP染色试剂盒均为DAKO公司的产品。其它试剂由广东省医学科学院提供。
5
方法
MKN－45胃癌细胞株的培养，按常规方法进行培养，即用含ml/L新生小牛血清的RPMI－培养基，添加适量HEPES(终浓度为10mmol/L)、抗生素(终浓度为u/mL的青霉素和g/mL的链霉素)和3%谷氨酰胺，置于37℃5%混合气体孵箱中培养。细胞换液时间为2～3d，3～5d传代，传代前以0.25%胰蛋白酶消化2～5min，取处于对数生长期的同一代细胞进行实验。
6
含药小鼠血清的制备
小鼠20只，重18～22g，分四组:对照组和蒲公英提取物三个浓度的剂量组。对照组予生理盐水灌胃，其它三组按浓度mg/ml，mg/ml和mg/ml区分，以10ml/kg分别予以灌胃，灌胃连续14d，最后一次灌胃1h后腹主动脉采血，以r/min速度离心5min，同组的所有小鼠血清混合，至于－70℃贮存，用前于56℃下灭活30min。
7
免疫组织化学检测法
使用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶法(SP法)，按试剂盒说明进行操作，用已知的阳性组织切片作为阳性对照物，以PBS代替一抗作为阴性对照。切片结果由一名对本研究不知情的病理医生判断。结果判断标准:细胞核呈清晰的棕色(或棕黄色，对于ki67来说)为阳性。Ki67的阳性表达率以测定的百分比作为结果。p53阳性细胞数＜10%为阴性(－)，10%～30%为+，31%～50%为++，＞50%为+++。
8
统计学方法
采用表示，两个率的差别用t检验，或Fisher直接概率检验法。p＜0.05则被认为两组之间有统计学上的显著性差异。
结果
4组中p53的表达分别为%(5/5)、60%(3/5)、80%(4/5)、60%(3/5)，由于样本量不足40，且实际数字中有一个为0，故将蒲公英提取物三个浓度的剂量组合并为一组与对照组进行比较，简化为四格表，用Fisher直接概率法进行检验，结果发现蒲公英提取物组的p53表达率低于对照组，差异有统计学意义(p＜0.05);在ki67蛋白方面，蒲公英提取物的三组的阳性率均高于对照组，但差异尚无统计学意义(p＞0.05)。总体而言，实验的证据强度不大。见表1、表2。
讨论
草药蒲公英长期以来在东亚尤其是中国的传统医学中被临床医生用来治疗癌症或推荐为防癌的食物补充品。近10年来，逐渐有一些相关的基础和临床实验报道，为草药蒲公英(或蒲公英属草药)的抗癌治疗积累了一些证据。这些报道所涉及的癌症包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌和白血病等等。亦有对鼻咽癌IMRT患者实施含蒲公英的中药复方鼻咽冲洗，能够明显减轻鼻咽黏膜反应、缩短住院时间、提高患者满意度［3］。P53蛋白是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，在癌的发生中p53基因的突变和丢失起着重要作用［4-5］。
核增殖相关抗原(Ki67)是有效评估肿瘤细胞增值活性的重要标志物，为目前检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标，涉及使用这两个指标的肿瘤研究也比较活跃。所以本研究选用了这两个指标。在较多的中草药的药物试验中，是将药液直接加到癌细胞上，而本实验则选用了小鼠血清制备的药液添加到培养的胃癌细胞株中，因为我们认为这可能更加接近体内药物成分作用的情形。通过降低p53的阳性表达可能是蒲公英抗癌作用的机制之一，也是其抗癌作用的依据之一。本实验，包括蒲公英对胃癌细胞ki67影响的证据性都比较弱，有待继续进一步研究。
参考文献
［1］许雪叶．云南白药联合红外线照射治疗哺乳期乳腺炎［J］．中国当代医药，，17(19):．
［2］王永中．复方蛸芨金英粉治疗消化性溃疡的机制探讨［J］．中国当代医药，，17(10):65，69．
［3］单佩佩．中药鼻咽冲洗在鼻咽癌调强放射治疗中的临床意义［J］．中国现代医生，，49(11):－．
［4］周亚东，甘润良．抑癌基因P53与胃癌的研究进展［J］．医学综述，，16(9):－．
［5］孙明霞，梦雅平，张军力．Ki－67抗原在临床疾病中的研究进展［J］．内蒙古医学杂志，，41(11):－．
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